Мышечная дистрофия Дюшенна (МДД) — тяжёлое Х-сцепленное наследственное заболевание, связанное с мутациями в гене DMD (гене дистрофина) и характеризующееся прогрессирующей дегенерацией мышечных волокон [1]. Дефицит или функциональная недостаточность данного белка приводит к структурной нестабильности мышечных волокон и их прогрессирующей дегенерации, ввиду чего заболевание проявляется проксимальной мышечной слабостью и быстрым прогрессированием симптомов. Первые клинические признаки появляются у пациентов в возрасте 3–5 лет: наблюдаются нарастающая мышечная слабость, снижение толерантности к нагрузкам, быстрая утомляемость, неуклюжесть, частые падения, затруднения при подъёме по лестнице. К 11 годам пациенты утрачивают способность к самостоятельному передвижению, а к 3-му десятилетию вследствие сердечно-лёгочных осложнений наступает смерть [1].

Мышечная дистрофия Беккера (МДБ) представляет собой более мягкую форму заболевания, манифестирующую в возрасте 10–20 лет. Для неё характерны медленное прогрессирование мышечной слабости с длительным сохранением подвижности; инвалидизация, как правило, развивается не ранее 40-летнего возраста [1].

Примерно у 8% женщин-носителей дефектного гена при наличии сопутствующих патологий (например, при полной или мозаичной формах синдрома Шерешевского–Тернера) также могут проявляться симптомы МДД. При этом у женщин заболевание, как правило, протекает в относительно более лёгкой форме: помимо умеренной мышечной слабости, часто выявляются сердечно-сосудистые нарушения, включая аритмии и дилатационную кардиомиопатию [1].

Своевременное выявление МДД имеет ключевое значение для организации медицинского наблюдения, раннего начала терапии и включения пациентов в клинические исследования. Наиболее распространённым биохимическим маркером заболевания является повышение активности креатинфосфокиназы (КФК) в крови. Самые высокие уровни (до 100 раз превышающие норму) КФК отмечаются на ранних стадиях заболевания (1–2 года жизни) и имеют тенденцию к снижению с возрастом и прогрессирующей потерей мышечной массы, хотя и остаются повышенными по сравнению с нормальными популяционными значениями. Это позволяет использовать этот показатель как в неонатальном скрининге (НС), так и в скрининге детей более старших возрастных групп [2, 3].

С середины 1970-х гг. в мировой практике реализован ряд пилотных проектов по НС на МДД. Первоначально применялись флуоресцентные методы определения КФК, чувствительность и специфичность которых ограничивались влиянием фоновых факторов. В дальнейшем разработка иммунофлуоресцентных технологий позволила селективно определять мышечную изоформу фермента (КФК-ММ), повысив точность тестирования. Дополнительным шагом, начиная с 1980-х гг., стало внедрение методов молекулярно-генетической диагностики, что позволило существенно снизить число ложноположительных результатов и обеспечить более надёжное подтверждение диагноза. Кроме того, с развитием технологий в скрининг стали чаще включаться дети обоих полов, что позволяет выявлять детей — носителей патологического варианта гена, а также девочек, у которых в связи с сопутствующими заболеваниями могут проявиться симптомы МДД.

Цель работы — провести обзор пилотных программ, направленных на раннее выявление МДД, включая проекты НС и исследования, проводившиеся в других популяциях, помимо новорождённых (НР).

Флуоресцентный анализ

Впервые метод тестирования НР на МДД с использованием сухих пятен крови был предложен в 1975 г. Флуоресцентный анализ активности КФК был протестирован на образцах крови 1500 НР, которые уже были взяты для проведения теста на фенилкетонурию [4]. У всех, кроме 2 НР, уровень КФК соответствовал нормальным значениям, при этом результаты этих 2 НР при повторном измерении спустя несколько месяцев также соответствовали норме [2, 4]. Таким образом, несмотря на отсутствие выявленных случаев МДД, данный проект положил начало развитию скрининговых программ на МДД по всему миру.

Позже НС на МДД с использованием флуоресцентного анализа сухих пятен крови был проведён в Новой Зеландии: 10 тыс. мальчиков были обследованы на МДД с использованием образца крови на фенилкетонурию, при этом было выявлено 2 случая значительного превышения уровня КФК у детей. Проведенный впоследствии анализ крови также зафиксировал значительно повышенный уровень КФК. Биопсия мышц подтвердила диагноз у одного из детей, и у обоих младенцев уровень КФК оставался значительно повышенным. При этом согласно медицинскому осмотру отклонений от нормы у данных пациентов не выявлено [5].

В 1976–1980 гг. аналогичный пилотный проект был проведён в Эдинбурге (Великобритания). По результатам скрининга 2336 протестированных младенцев мужского пола у 16 уровень КФК превышал пороговое значение, при этом при повторном анализе данное повышение не подтвердилось ни у одного из них. С момента внедрения более чувствительных реагентов в середине 1979 г. у 850 человек, прошедших тестирование, не было обнаружено ни одного ложноположительного результата — таким образом, по результатам данного проекта не выявлено ни одного пациента с МДД [6].

В результате проведённого в 1977–1984 гг. в Западной Германии пилотного проекта, в ходе которого было обследовано 176 600 мальчиков мужского пола, у 48 из них (всем было меньше 6 мес) были значительно повышены уровни мышечной изоформы КФК — КФК-ММ (двукратное повышение более 300 МЕ/л), что авторы пилотного проекта определили как вероятное наличие диагноза МДД (частота 1:3679). Следует отметить различный возраст мальчиков на момент проведения скрининга — около 65% мальчиков, прошедших тестирование в конце 1984 г., были в возрасте 4–6 нед; 23% — от 6 нед до 6 мес, 2% — от 6 мес до года, 10% — моложе 4 нед и 0,3% — старше 1 года [7]. По результатам более поздней публикации (включающей результаты до 2011 г., когда скрининг был завершён) всего за 1977–2011 гг. было протестировано 528 410 мальчиков, в основном в возрасте 4–6 нед. За эти 34 года НС было выявлено 147 мальчиков с МДД и 33 мальчика с МДБ.

До развития методов генетической диагностики возможности проведения подтверждающей диагностики были существенно ограничены. Иногда результаты скрининга оставались неподтверждёнными до проявления клинических проявлений заболевания. Однако уже в 1988 г. были опубликованы результаты пилотного проекта в провинции Манитоба (Канада), где проводилась генетическая диагностика мутаций. По результатам скрининга из 18 тыс. новорождённых мальчиков у 3 были выявлены молекулярные делеции или дупликации [8].

Реализованный позже на Кипре национальный пилотный проект НС на МДД проводился также методом измерения уровня КФК в сухих пятнах крови с последующим генетическим подтверждением. В течение первых 6 лет программы (1992–1997 гг.) для проведения скрининга было получено 30 014 образцов, из которых 43 характеризовались изначально высокими значениями КФК (более 300 МЕ/л), однако для повторного анализа было доступно только 35 образцов. Из числа повторных проб в 30 активность КФК соответствовала нормальным значениям, а у 5 мальчиков было отмечено стойкое повышение уровня КФК. Впоследствии проведённый генетический анализ и анализ дистрофина подтвердил диагноз у всех 5 мальчиков. При этом в течение 1-го года реализации программы все образцы были проанализированы как методом фотокассет, так и количественно с помощью люминометра, после чего было отмечено, что все образцы с активностью КФК выше порогового значения (300 МЕ/л) были отобраны методом фотокассет, и в последующие годы количественный анализ с помощью люминометра проводился только тех образцов с повышенной активностью КФК, измеренной по методу фотокассет [9].

В Антверпене в 1979–2003 гг. было обследовано 281 214 новорождённых мальчиков, у 51 из которых отмечался персистирующий высокий уровень активности КФК-ММ (выше 500 МЕ/л), а у 42 мальчиков уровень КФК-ММ был повышен транзиторно и не подтверждён при повторном тестировании. Кроме того, отмечается, что 2 мальчика с МДД были пропущены при проведении скрининга [10].

Результаты пилотного проекта по НС во Франции были представлены на заседании рабочей группы Европейского нервно-мышечного центра и затем обновлены D. Bradley и E. Parsons в личной переписке c исследователями, ответственными за проведение скрининга: всего в 1975–1996 гг. было обследовано 434 461 НР, из них у 89 мальчиков были выявлены МДД/МДБ [11, 12].

Один из самых длительных проектов скрининга был проведён в Уэльсе (с 1990 по 2011 г.). Всего в лабораторию поступило 369 780 образцов пятен крови новорождённых мальчиков, из которых у 145 образцов была выявлена повышенная активность КФК. Диагноз МДД был подтверждён у 56 пациентов, а 10 детей имели МДБ или другие дистрофии. Кроме того, у 13 детей, несмотря на отрицательный результат НС, впоследствии была выявлена МДД [13].

К 2012 г. все указанные программы, кроме скрининга в Антверпене, были прекращены. Уэльская/Антверпенская модель НС требовала повторного анализа венозной крови через несколько недель после рождения, что ограничивало её применение в странах с менее централизованной системой здравоохранения [14]. Кроме того, определение активности КФК в сухих пятнах крови методом флуоресцентного анализа ограничено влиянием эндогенного АТФ и малым объёмом элюируемого образца, что требует повышенной чувствительности метода [3].

Последний пилотный проект с применением флюорометрии (без применения иммунофлуоресцентного анализа) был проведён в штате Огайо и завершён в 2012 г. В ходе исследования мутации гена DMD (экзонные делеции) были обнаружены у 6 из 37 649 НР мужского пола (каждый из которых имел уровень КФК > 2000 ЕД/л). У 3 НР с уровнем КФК > 2000 ЕД/л аномалии гена DMD не были обнаружены, при этом были выявлены мутации генов DYSF, SGCB и FKRP, обусловливающих прочие дистрофии конечностей [14].

Иммунофлуоресцентный анализ

Следующим этапом развития скрининга на МДД стала разработка специфического теста на активность КФК-ММ в сухих пятнах крови на основе иммунофлуоресцентного анализа (ИФА). Применение данного теста позволило селективно оценивать уровень КФК-ММ в пятнах крови, что улучшило чувствительность и специфичность тестирования, а также позволило стандартизовать оценку уровня КФК среди всех регионов, организовавших скрининг.

Для оценки чувствительности и специфичности теста было проведено исследование в двух популяциях: США и Дании. Результаты скрининга на 719 архивных образцах пятен крови НР в США показали 100% чувствительность теста, в то время как в Дании по результатам тестирования были выявлены 15 из 16 образцов от мальчиков с МДД [3].

За последние 5 лет в нескольких регионах были инициированы пилотные проекты НС на МДД с использованием данного теста.

Так, в Нью-Йорке программа пилотного тестирования была запущена в октябре 2019 г. в сотрудничестве с Сетью трансляционных исследований НС (Newborn Screening Translational Research Network, NBSTRN), родительским сообществом и штатом Нью-Йорк. По результатам двухлетнего пилотного проекта был протестирован 36 781 ребёнок. Результаты скрининга разделялись на три группы: нормальные значения КФК-ММ (36 445 детей), пограничные значения КФК-ММ (296 детей) и значения КФК-ММ, предварительно соответствующие диагнозу МДД (40 детей). После повторного анализа результаты 2 детей также были отнесены в последнюю группу. По результатам генетического обследования у 4 мальчиков были обнаружены делеции или дупликации в гене DMD, соответствующие МДД или МДБ, а также выявлена 1 девочка-носительница МДД [15]. По результатам 3-летнего периода из приблизительно 650 тыс. НР у 34 детей было выявлено заболевание, и все они были направлены в специализированный центр помощи пациентам с нервно-мышечными заболеваниями [16].

В Северной Каролине по результатам анализа 13 354 НР с помощью анализа КФК-ММ было выявлено 84 НР с повышенным уровнем КФК-ММ. По результатам генетической диагностики и измерения активности КФК в венозной крови были выявлены 2 мальчика с патогенными вариантами в гене DMD и 1 мальчик с аутосомно-доминантным патогенным вариантом в другом гене [17, 18].

Аналогичные проекты по измерению активности КФК-ММ при помощи ИФА были инициированы в провинциях Чжэцзян, Гуанчжоу, Хэнань и Нинся-Хуэйском автономном районе в Китае.

В г. Ханчжоу (провинция Чжэцзян) согласно пилотному исследованию на 18 424 образцов высушенной крови НР было выявлено 13 образцов с повышенным значением КФК-ММ (более 700 нг/мл в крови), из которых 4 случая были классифицированы как истинно-положительные случаи МДД [19].

В Гуанчжоу в качестве порогового значения активности КФК-ММ на первом этапе скрининга устанавливалось значение 800 нг/мл. В процессе скрининга было исследовано 62 553 НР, в том числе 44 268 мальчиков и 18 285 девочек. По результатам первичного анализа высокий уровень КФК-ММ был обнаружен у 164 человек, по результатам повторного теста — у 6. Всего по результатам анализа было выявлено 4 случая МДД, ещё у 1 ребёнка найдено другое мышечное заболевание [20].

В Хэнане по результатам анализа КФК-MM у 13 110 новорождённых мальчиков было выявлено 3 случая МДД, все они имели уровень КФК-MM > 600 нг/мл [21].

По результатам пилотного проекта в Нинся-Хуэйском автономном районе, проведённом на 10 тыс. НР, было зарегистрировано 10 случаев с активностью КФК-ММ ≥ 468,57 нг/мл, из них у 2 пациентов был подтверждён диагноз МДД [22].

В Тайване измерение КФК-ММ проводили трехкратно: у 50 572 НР была проведена оценка концентрации КФК-MM, в среднем в возрасте 3 дней, повышение уровня КФК-MM (выше 750 нг/мл для доношенных детей и 650 нг/мл для недоношенных) было выявлено у 1,2% НР. По результатам двух повторных измерений были выявлены 3 пациента с повышенным уровнем КФК-ММ, при этом наличие мутаций в гене DMD было подтверждено у всех 3 пациентов [23].

Помимо улучшения предварительного этапа скрининга — определения уровня КФК в крови, совершенствуется генетическая диагностика заболевания. Так, в 2021 г. в США внедрили программу по НС МДД, предполагающую определение активности КФК c помощью вышеописанного иммунофлуоресцентного теста, последовательное таргетное секвенирование следующего поколения (targeted next-generation sequencing, tNGS) и полноэкзомное секвенирование (whole-exome sequencing, WES). Анализ tNGS/WES объединяет в себе способность обнаруживать как точечные мутации, так и делеции/дупликации гена DMD. В течение 3-месячного периода были проанализированы 1379 образцов, у 29 из которых был обнаружен повышенный уровень КФК, при этом по результатам генетического анализа ни у одного пациента МДД не была выявлена [24].

Сводная информация о всех найденных пилотных программах приведена в таблице. Распространённость МДД на 10 тыс. детей по результатам программ НС представлена на рисунке.

Прочие скрининговые программы

Помимо скрининговых программ НР для выявления МДД проводились пилотные проекты по измерению уровня КФК у детей дошкольного возраста. Так, в 1986–1987 гг. в Уэльсе было предложено тестировать мальчиков, которые не могут самостоятельно ходить к 18 мес, таким образом повысив возраст скрининга по сравнению с существовавшим в то время в Уэльсе скринингом НР. Однако скрининг прошли менее 50% неходячих мальчиков (по результатам анализа выявлено всего 2 пациента), несмотря на значительные усилия команды проекта. Организаторы пришли к выводу о том, что с учётом доли мальчиков, которые не могут ходить в 18 мес (50% от всех пациентов с МДД), и низкого охвата скринингом в ходе данного проекта могло быть выявлено только 25% мальчиков с МДД среди всей соответствующей популяции [26].

В Атланте в 2007 г. измерение уровня КФК проводили у детей, достигших возраста 1 года, в рамках плановых осмотров. Всего были проанализированы 264 образца, при этом все образцы находились в пределах нормального референсного диапазона КФК. Таким образом, дальнейшее тестирование не проводилось, и все младенцы мужского пола получили отрицательный результат скрининга [27].

В Израиле был проведён проект по выявлению мутаций в гене DMD среди населения с целью определения распространённости носительства МДД. Группа из 12 362 женщин была протестирована с использованием ряда генетических методов (MLPA с последующим секвенированием области праймера при подозрении на делецию 1 экзона). По результатам исследования у 11 женщин были обнаружены мутации в гене DMD, что соответствует частоте носительства 1:1374, при этом о семейном анамнезе заболевания сообщалось только в 3 случаях [28]. Согласно более поздним результатам анализа более 85 737 тестов на МДД частота носительства была скорректирована и составила 1:1046 женщин [29].

Этические и психологические аспекты неонатального скрининга на МДД

В процессе совершенствования технологий постепенно изменялись и этические аспекты диагностики МДД, преимущественно в контексте НС. Если до появления таргетных лекарственных препаратов, влияющих на продукцию дистрофина, ключевым оставался вопрос о целесообразности выявления заболевания до возраста, рационального для начала терапии глюкокортикостероидами, то регистрация новых терапевтических опций (аталурена в 2014 г., этеплирсена в 2016 г.) стимулировала развитие программ НС в Европе и Соединенных Штатах Америки. По результатам опроса семей, воспитывающих ребёнка с МДД (2022 г.), было показано, что 30% респондентов предпочли бы получить диагноз непосредственно после рождения пациента независимо от наличия доступных методов лечения, а подавляющее большинство (93%) выразило готовность узнать диагноз при условии существования эффективных терапевтических подходов на ранних стадиях заболевания [30]. В исследовании, проведённом в 2023 г., 80% опекунов пациентов с МДД указали, что считают установление диагноза сразу после рождения оптимальным и согласились бы на проведение НС при его доступности. Среди наиболее значимых преимуществ досимптоматической диагностики они отмечали возможность более раннего начала многопрофильного наблюдения за пациентом (58%), участие в клинических исследованиях (54%), получение психологической поддержки (56%), доступ к информации для репродуктивного планирования (54%), а также более своевременное финансовое планирование в связи с потребностями ребёнка (54%) [31].

Схожие выводы демонстрируют исследования семей с несколькими детьми, страдающими МДД: у детей младшего возраста диагноз был поставлен в среднем на 2 года раньше, чем у детей старшего возраста, причём у 27,0% из них диагноз был установлен в течение 1-го года после рождения. По мнению авторов исследования, данные результаты могут быть связаны с внедрением программ НС и сопутствующих практик — генетического консультирования, тестирования матерей на носительство мутаций и генетической диагностики братьев и сестёр [32].

В то же время остаются актуальными опасения относительно потенциального негативного влияния ранней постановки диагноза на эмоциональное развитие ребёнка и отношения в семье [33]. Однако по результатам отдельного психологического исследования, проведённого среди семей детей, получивших истинно- и ложноположительные результаты скрининга, не выявлено признаков долгосрочного нарушения отношений матери и ребёнка [34]. Более того, практически все пациенты и большинство родителей положительно относились к НС [31]. При этом родители детей, у которых диагноз был установлен в результате проведения НС, рассматривали его преимущественно как полезный опыт, тогда как семьи, в которых заболевание было диагностировано после манифестации симптомов, чаще выражали обеспокоенность, что досимптоматическая диагностика может усиливать тревожность родителей [35].

Заключение

Современное развитие технологий НС открывает возможности для выявления МДД ещё до появления клинических симптомов заболевания, что имеет критическое значение как для организации своевременного наблюдения за пациентом и начала терапии, так и для проведения генетического консультирования семей и планирования потребности пациентов на последующих этапах заболевания.

Проведённые в различных странах пилотные проекты продемонстрировали, что определение активности КФК в сухих пятнах крови с последующим подтверждением диагноза с использованием молекулярно-генетических методов может служить эффективным инструментом диагностики. Несмотря на различия в применяемых подходах, общими характеристиками программ являются многоэтапность обследования, использование специфичных тестов для оценки КФК-ММ, а также обязательное проведение генетического подтверждения.

Таким образом, международный опыт подтверждает практическую возможность включения НС на МДД в программы массового обследования НР, что приобретает особое значение в условиях появления новых терапевтических подходов, эффективность которых напрямую зависит от ранней диагностики.