Введение

Появление патогенетической/генной терапии спинальной мышечной атрофии (СМА) и внедрение расширенного неонатального скрининга на всей территории России обусловили значительные успехи в лечении данной патологии. Инструментальные и биохимические методы оценки эффективности патогенетической терапии СМА находятся в стадии изучения. В качестве потенциальных биомаркеров заболеваний, характеризующих повреждение и дегенерацию аксонов, к которым в том числе относится СМА, рассматриваются белки нейрофиламентов (НФ).

Белки НФ — нейронспецифические компоненты цитоскелета, которые различаются по относительной молекулярной массе. Крупнейшей из них является тяжёлая цепь НФ (200 кДа), за которой в порядке убывания молекулярной массы следуют средняя цепь (150 кДа), лёгкая цепь (70 кДа), α-интернексин (66 кДа) и периферин (57 кДа) [1, 2]. Роль НФ в нейронах до конца не изучена. НФ являются преимущественно аксональными структурными компонентами, участвуют в нейрональной проводимости, способствуют росту и стабильности аксонов как в центральных, так и в периферических нервах, а также поддерживают стабильность митохондрий содержимого микротрубочек [3]. При аксональном повреждении и гибели нейронов белки НФ высвобождаются в спинномозговую жидкость и дренируются в кровоток через арахноидальные грануляции в измеримых количествах [4]. Полученные достоверные корреляции между концентрациями НФ в плазме и ликворе позволили расширить спектр исследований НФ за счёт малоинвазивной и доступной процедуры забора крови по сравнению с диагностической люмбальной пункцией [5–9]. В исследованиях наибольшую значимость в качестве диагностических и прогностических маркеров получили лёгкие и тяжёлые цепи НФ [10–15].

Для измерения уровней белков НФ применяются количественные методы иммуноферментного анализа (ИФА): стандартный ИФА (sELISA), иммунополимеразная цепная реакция (иммуноколичественный ИФА или IQELISA) и высокочувствительный ИФА (SIMOA). Все методы различаются по используемым субстратам, способам обнаружения, чувствительности и объёмам образцов [16]. Основным преимуществом sELISA является наличие доступных наборов, позволяющих измерять множество различных белков; sELISA не требует специальной подготовки специалистов, позволяет легко интерпретировать данные и использует считыватель микропланшетов, совместимый с другими методами анализа. Эти преимущества привели к широкому использованию sELISA в научных исследованиях.

При IQELISA антитела для захвата наносятся на пластиковую 96-луночную пластину для полимеразной цепной реакции (ПЦР), в то время как обнаруживаемое антитело конъюгируется с уникальным штрих-кодом ДНК. Для проведения IQELISA используется небольшой объём исследуемого материала (~10 мкл). Однако по сравнению с sELISA, проведение метода IQELISA технически более сложное и для повышения достоверности полученных результатов требуется проведение исследования минимум в 3 пробах [16, 17].

Метод SIMOA — сверхчувствительный метод ИФА для количественного определения белковых биомаркеров с высокой точностью и производительностью, который использует гранулы, покрытые антителами, и флуоресцентно конъюгированные антитела для их обнаружения. Ключевым преимуществом SIMOA является то, что он может обнаруживать белки в фемтомолярном диапазоне [18]. Несмотря на то, что SIMOA обеспечивает самую высокую чувствительность из трех рассмотренных методов, у этой технологии есть ряд недостатков: количество белков, анализируемых с помощью этой технологии, составляет менее 200; прибор и наборы SIMOA не совместимы с другими видами ИФА, метод является дорогостоящим и требующим специальной подготовки [16].

С появлением методов определения НФ наблюдается увеличение количества исследований уровней НФ у пациентов при различных неврологических заболеваниях [5, 9, 19–21].

Белки НФ исследуются у пациентов с СМА, рассеянным склерозом, болезнями Альцгеймера и Паркинсона, Шарко–Мари–Тута, боковым амиотрофическим склерозом и лейкоэнцефалопатией у взрослых с аксональными сфероидами и пигментированной глией, а также при тяжёлых перинатальных повреждениях центральной нервной системы, асфиксии, неонатальных судорогах и др. [2, 6, 7, 19, 22–30].

Одной из актуальных проблем при исследовании уровней НФ является определение их референсных значений, поиск зависимостей от пола и возраста, наличия сопутствующей патологии и т. д. При анализе статей, посвящённых определению уровней НФ у пациентов с неврологической патологией, установлено, что в большинстве работ сравнение исследуемой группы проводилось не с группой нормы, а с группой контроля, в которую были включены индивиды без «неврологической симптоматики, острых/хронических воспалительных процессов, аутоиммунных заболеваний» в широком возрастном диапазоне; при этом показатели группы контроля варьировали и при статистическом анализе в ряде случаев не подчинялись гауссовскому распределению [2, 5, 18–21, 24, 31]. Поскольку на сегодняшний день существуют три основных метода определения уровней НФ, значения показателей в контрольных группах, установленных различными методами, не подлежат прямому сравнению. Вышеуказанные факторы объясняют отсутствие нормативных значений уровней НФ в реальной клинической практике.

Ряд авторов отмечают, что у пациентов с неврологической патологией изменение показателей уровней НФ в динамике является более значимым прогностическим фактором, чем сравнение с показателями контрольных групп [2, 32–35]. Доказано, что при нейрональном повреждении уровень НФ в ликворе и крови повышается [28, 36–38].

Ряд работ посвящён исследованию уровней НФ у детей с СМА. B.T. Darras и соавт. отметили, что у участников исследования ENDEAR (13-месячное многоцентровое рандомизированное плацебо-контролируемое исследование препарата нусинерсен у младенцев с инфантильным началом СМА) медиана исходного уровня тяжёлых цепей НФ (15 400 пг/мл; 2390–50 100; n = 117) была примерно в 10 раз выше, чем у детей того же возраста без СМА (р < 0,0001) [39].

У пациентов с СМА после проведения патогенетической терапии препаратом нусинерсеном уровень НФ в плазме крови снизился на 90,1% за 10 мес. У больных с СМА, вошедших в группу плацебо, несмотря на отсутствие патогенетического лечения, также произошло снижение уровней НФ (60,3% за 10 мес), что позволило авторам сделать вывод о том, что процессы нейродегенерации наиболее активны в дебюте заболевания [39].

С.R.R. Alves и соавт. при исследовании НФ в сыворотке крови и ликворе у детей с СМА отметили, что повышение уровней тяжёлых и лёгких цепей НФ обратно пропорционально количеству копий гена SMN2 [40]. При анализе различных вариантов патогенетической терапии детей с СМА авторы установили, что у детей, получавших монотерапию онасемногеном абепарвовеком (ОА), наблюдалось начальное резкое повышение уровня НФ в крови, тогда как у пациентов, получивших ОА после предварительной терапии нусинерсеном, подъёма уровней НФ в сыворотке крови не отмечалось. Данный феномен C.R.R. Alves и соавт. (2021) объяснили защитным эффектом предшествующей терапии нусинерсеном. Спустя некоторое время после введения ОА уровни НФ в сыворотке крови также снижались [40, 41]. Таким образом, несмотря на неоднозначность данных литературы, определение уровней НФ в сыворотке крови и ликворе может является перспективным биомаркером заболевания, а также способом оценки эффективности патогенетической терапии СМА.

Цель исследования — определить уровни НФ в сыворотке крови детей в возрасте 0–24 мес с СМА I типа и на пресимптоматической стадии заболевания до и после проведения генной терапии ОА.

Материалы и методы

В основную группу (I) были включены 79 детей со СМА. Диагноз был верифицирован при проведении молекулярно-генетического исследования, у всех детей была выявлена делеция экзонов 7 или 7–8 гена SMN1 в гомозиготном состоянии. Все пациенты получили генную терапию препаратом ОА, средний возраст на момент проведения терапии составил 2,90 ± 1,74 мес (95% ДИ 2,51–3,29), min — 1,00, max — 7,00.

Дети были распределены на 2 подгруппы в зависимости от наличия или отсутствия у них симптомов СМА на момент включения в исследование. В подгруппу Ia включены 44 ребёнка (22 (50,0%) мальчика и 22 (50,0%) девочки) с инфантильным дебютом СМА 1 типа). У абсолютного большинства пациентов подгруппы Ia было 2 копии гена SMN2 — 43 (97,7%), у 1 (2,3%) пациента — 3 копии. Возраст дебюта клинических симптомов в подгруппе Ia составил 1,15 ± 1,10 мес (95% ДИ 0,81–1,49), min — с рождения, max — 4,5 мес.

В подгруппу Ib вошли 35 детей (20 (57,1%) мальчиков и 15 (42,9%) девочек) с СМА на пресимптоматической стадии. У абсолютного большинства пациентов подгруппы Ib было 3 копии гена SMN2 — 31 (88,6%), у 4 (11,4%) — 2 копии.

В группу контроля были включены 76 неврологически здоровых детей в возрасте 0–24 мес: до 1 мес — 24 (31,6%), 1–6 мес — 18 (23,7%), 7–12 мес — 18 (23,7%), 13–24 мес — 16 (21%).

У всех детей с СМА уровни лёгких и тяжёлых цепей НФ были исследованы методом ИФА. Забор крови для исследования осуществлялся в строго ограниченном количестве из периферических вен, после оценки соматического статуса ребенка, а также с учётом массы тела пациента. Забор проводился только после получения информированного согласия родителей/законных представителей ребенка.

Уровни нейрофиламентов в сыворотке крови исследовали методом ИФА с применением следующих наборов реактивов: для определения протеина НФ 68 кДa (лёгкие цепи НФ) — «ELISA Kit for Neurofilament, Light Polypeptide (NEFL)»; протеина нейрофиламента 200 кДa (тяжёлые цепи НФ) — «ELISA Kit for Neurofilament, Heavy Polypeptide (NEFH)» («Cloud-Clone Corp») с использованием оборудования «Tecan Austria Sunrise» и «Tecan Austria HydroFlex» («Tecan»).

Статистический анализ проводили с использованием программы «StatTech v. 4.8.0» («Статтех»).

Количественные показатели оценивали на предмет соответствия нормальному распределению с помощью критерия Шапиро–Уилка (при числе исследуемых менее 50) или критерия Колмогорова–Смирнова (при числе исследуемых более 50).

Количественные показатели, выборочное распределение которых соответствовало нормальному, описывали с помощью средних арифметических величин (M) и стандартных отклонений (SD). В качестве меры репрезентативности для средних значений указывали границы 95% доверительного интервала (ДИ). В случае отсутствия нормального распределения количественные данные описывали с помощью медианы (Me) и нижнего и верхнего квартилей [Q1; Q3]. Категориальные данные описывали с указанием абсолютных значений (n) и долей (%). Сравнение двух групп по количественному показателю, распределение которого в каждой из групп соответствовало нормальному, при неравных дисперсиях выполняли с помощью t-критерия Уэлча. Сравнение двух групп по количественному показателю, распределение которого отличалось от нормального, выполняли с помощью U-критерия Манна–Уитни. Сравнение 3 и более групп по количественному показателю, распределение которого в каждой из групп соответствовало нормальному, выполняли с помощью однофакторного дисперсионного анализа, апостериорные сравнения проводили с помощью критерия Тьюки (при условии равенства дисперсий), критерия Геймса–Хауэлла (при неравных дисперсиях). Сравнение 3 и более групп по количественному показателю, распределение которого отличалось от нормального, выполняли с помощью критерия Краскела–Уоллиса, апостериорные сравнения — с помощью критерия Данна с поправкой Холма. В связи с тем, что значения большинства показателей не подчинялись нормальному распределению, направление и тесноту корреляционной связи между двумя количественными показателями оценивали с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена. Коэффициент корреляции интерпретировали по шкале Чеддока: 0,1–0,3 — слабый; 0,3–0,5 — умеренный; 0,5–0,7 — заметный; более 0,7 — высокий. Различия считали статистически значимыми при p < 0,05.

Результаты

При исследовании уровней лёгких и тяжёлых цепей НФ в сыворотке крови в группе контроля и в основной группе полученные показатели не подчинялись гауссовскому распределению и описывались с помощью непараметрических методов: медианы (Me), процентилей (от 5-го до 95-го), минимума и максимума. В табл. 1 отражены статистические характеристики лёгких и тяжёлых цепей НФ в сыворотке крови в группе детей с СМА до терапии ОА.

В дальнейшем внутри группы контроля был проведён корреляционный анализ зависимости уровней лёгких и тяжёлых цепей НФ в сыворотке крови от возраста детей — с 0 до 24 мес (рис. 1) и установлена незначимая слабой тесноты прямая связь (р = 0,07 и р = 0,14 соответственно). С учётом отсутствия значимой корреляционной связи между возрастом детей и уровнями лёгких и тяжёлых цепей НФ в сыворотке крови показатели группы контроля использовались в дальнейшей обработке данных исследования без разделения на возрастные категории.

Уровень лёгких цепей НФ в подгруппе Iа до лечения был достоверно выше, чем в подгруппе Ib и в группе контроля (табл. 2), уровень тяжёлых цепей НФ в подгруппе Iа до лечения также был достоверно выше, чем в группе контроля (табл. 2). Значимых различий уровней лёгких и тяжёлых цепей НФ в сыворотке крови между подгруппой Ib до генной терапии и группой контроля не выявлено.

В подгруппе Ia отмечено достоверное снижение (р < 0,01) уровней лёгких цепей НФ в сыворотке крови через 3–6 мес после проведения генной терапии ОА (Ме = 22,97 [6,00; 48,54]) по сравнению с данными показателями до лечения (Ме = 6,0 [5,92; 7,78]). Через 7–12 мес (Ме = 6,15 [5,15; 7,30]) и 13–24 мес (Ме = 6,0 [5,7; 6,6]) отмечена стабилизация показателей Ме с уменьшением интерквартильных размахов (рис. 2, а). На рис. 2, б проиллюстрирована динамика средних значений уровней лёгких цепей НФ в сыворотке крови в подгруппе Iа: через 3–6 мес после проведения генной терапии отмечено резкое снижение показателей, через 7–12 мес и 13–24 мес — более плавное снижение.

В подгруппе Ib отмечено достоверное снижение (р < 0,01) уровней лёгких цепей НФ в сыворотке крови через 3–6 мес после проведения генной терапии (Ме = 6,0 [6,00; 7,25]) по сравнению с уровнями лёгких цепей НФ до лечения (Ме = 6,0 [6,00; 31,43]) за счёт уменьшения интерквартильных размахов при одинаковом уровне Ме (рис. 2). Через 7–12 (Ме = 6,0 [5,00; 6,00]) и 13–24 (Ме = 6,0 [5,00; 6,00]) мес после проведения генной терапии ОА продолжено снижение интерквартильных размахов при сохранении прежнего уровня Ме.

Анализ динамики уровней тяжёлых цепей НФ в сыворотке крови после проведения генной терапии ОА как в подгруппе Ia, так и в подгруппе Ib выявил те же закономерности, что и анализ динамики лёгких цепей НФ: достоверное снижение уровня тяжёлых цепей НФ через 3–6 мес после введения ОА (рис. 3) и в дальнейшем, через 7–12 и 13–24 мес, плавное снижение Ме при уменьшении интерквартильных размахов.

Достоверные статистические различия отмечены только между уровнями лёгких цепей НФ в сыворотке крови у детей группы контроля и подгруппы Ia через 3–6 мес после терапии ОА (р = 0,01); через 7–12 и 13–24 мес показатели уже не имели статистических различий. Уровни тяжёлых цепей НФ в сыворотке крови у детей группы контроля и подгруппы Ia через 3–6, 7–12 и 13–24 мес после терапии ОА значимо не различались. Достоверных различий в показателях как лёгких, так и тяжёлых цепей НФ в сыворотке крови между группой контроля и подгруппой Ib через 3–6, 7–12 и 13–24 мес после терапии ОА не выявлено.

Заключение

На основании проведённого исследования уровней лёгких и тяжёлых цепей НФ в сыворотке крови у детей без неврологической патологии и с СМА были установлены следующие закономерности.

У детей без неврологической патологии в возрасте 0–24 мес уровни лёгких и тяжёлых цепей НФ в сыворотке крови характеризуются широким разбросом показателей, не подчиняются нормальному распределению и не имеют корреляционной связи с возрастом, что согласуется с данными о вариативности уровней НФ, полученных методами ИФА [2, 5].

У пациентов на пресимптоматической стадии СМА статистические различия уровней лёгких и тяжёлых цепей НФ в сыворотке крови в сравнении с группой контроля отсутствуют. При этом у детей с инфантильным дебютом СМА имеют место достоверно более высокие показатели НФ по сравнению как с детьми с СМА без клинических симптомов заболевания, так и с группой контроля, что указывает на развёрнутые процессы нейродегенерации при наличии клинической картины болезни.

Применение генной терапии у пациентов с СМА замедляет дегенерацию α-мотонейронов передних рогов спинного мозга, что проявляется значимым снижением уровней лёгких и тяжёлых цепей НФ в сыворотке крови при оценке данных показателей в динамике. Максимальное снижение показателей НФ отмечается через 3–6 мес после лечения ОА.

Таким образом, определение уровней лёгких и тяжёлых цепей НФ в сыворотке крови у пациентов с СМА до и после генной терапии может расцениваться как маркер тяжести заболевания и эффективности лечения.